Nội dung chính
Xem Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2024
13 gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV bước sóng 312 nm Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2000.
2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR 2.4.2.1. DNA khuôn
DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một
lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khn xuống còn 100 ng. Nếu lượng
DNA khn q cao có thể tạo ra những sản phẩm khơng như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khn DNA có thể được thu
nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần
2.4.2.2. Enzyme
Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase được
tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa
ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khn và ion Mn
++
, nhưng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg
++
, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.
2.4.2.3. Primer và nhiệt độ lai
Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:
– Trình tự primer được chọn sao cho khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược, khơng có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ
sung giữa các phần khác nhau của một primer.
14 – Nhiệt độ nóng chảy của primer xi và primer ngược không cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần.
– Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại trên gen.
– Trình tự nằm giữa hai primer xi và primer ngược không được quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
2.4.2.4. Các thành phần khác trong phản ứng PCR
– Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính
giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
– Nồng độ Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường
nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng.
2.4.2.5. Số lượng chu kỳ phản ứng
Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các
thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng
tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu.
15
2.4.2.6. Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR
Thiết bị cho phản ứng PCR như máy luân nhiệt thermocycler cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc
thốt hơi nước trong q trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả
năng truyền nhiệt tốt.
2.5. Enzyme cắt giới hạn restriction endonuclease – RE 2.5.1. Giới thiệu
Bạn đang tìm hiểu bài viết: Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2024
HỆ THỐNG CỬA HÀNG TRÙM SỈ QUẢNG CHÂU
Điện thoại: 092.484.9483
Zalo: 092.484.9483
Facebook: https://facebook.com/giatlathuhuongcom/
Website: Trumsiquangchau.com
Địa chỉ: Ngõ 346 Nam Dư, Trần Phú, Hoàng Mai, Hà Nội.
